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转录组拼接踩过的那么些坑,北京生科院提出基因组重复区域创设新算法

2019年7月6日 - 美高梅mgm02233.com
转录组拼接踩过的那么些坑,北京生科院提出基因组重复区域创设新算法

二〇一四年10月,国际学术期刊《核酸研究》(Nucleic Acids
Research
)公布了中国中国科学技术大学学香水之都生命科研院总括基因组学实验室赵方庆集团题为The
combination of direct and paired link graphs can boost repetitive genome
assembly

的新颖研商成果。该研讨根据类别重叠部分创设了contig的第一手连接音讯图,并在其配成对连年新闻的帮扶下,消除了由短片段重复连串变成的基因组拼接碎片化难点,在保证正确性的前提下延长了体系的长短,获得了更完整、间隙更加少的基因组类别。

de Bruijn graph

De Bruijn
是近些日子最常用的二代测序拼接算法。相比流行的拼凑软件如Velvet、Abyss和SOAP
denovo都应用该算法。

与OLC分化之处在于,那么些算法将已经异常的短的reads再分割成更七个kmer短连串(k
小于reads
系列的尺寸),相邻的kmers系列通过(k-1)个碱基连接到共同(即每回只移动一个岗位),进而收缩算法计算重叠区域的复杂度,减弱内部存储器消耗。

此地的kmer首先不能够太短,比方2个碱基肯定拼不出去基因组,它的长度既需求能够使其带领丰富的基因组的音讯,也要短到能够进行一连的谬误考订。除外,三个read中型Mini的有个别被分割之后还不会抛弃原本reads
的光景地点新闻。

总体来讲,该算法将reads打断成长度为K的核酸片段,再用Kmer间的overlap关系创设DBG,最终通过DBG得到基因组类别。

东拼西凑步骤经常包蕴:

如下图,1和2多少个种类会拼接成一条长的类别,在引进第三条体系后会出现三个圆环。

图片 1

下图是三个最简便易行的DBG拓扑结构,一球一线(一进一出)代表相邻的多个kmer,圆圈则意味有种种一而再方式。

图片 2

下图是三种广泛的DBG结构,分别表示了拼接进度中的区别景况。

图片 3

合并路线中出度入度独一(one incoming and one outcoming
)的节点,去除段末端,低覆盖度节点和泡状结构。

图片 4

搜求最优路线(经过各种节点且仅通过三回),最优路径对应的碱基连串构成多个contig

经过PE reads
地方消息明确contig之间的相对地方和自由化,组装contig,填充contig之间的gap,得到scaffold体系。

多少个注意事项

  1. 当把双链音讯思考进来未来,恐怕的连日情状就能够扩大,因为其余一个节点都恐怕和有个别节点的反向互补类别相连。

  2. 有再一次区域时的情事如下图所示,能够窥见,三个规定的genome只也是有叁个DBG,但转头一个DBG不肯定找到的是头一无二的地下基因组。

图片 5

4.3 ALLPATHS-LG主顺序的运用

使用RunAllPathsLG那么些命令来进展基因组组装,该命令有多数参数,但是在一般景观下不要自由使用,使用暗许设置就可以。

#!/bin/sh
# assemble.sh
# ALLPATHS-LG needs 100 MB of stack space.  In 'csh' run 'limit stacksize 100000'.
ulimit -s 100000

RunAllPathsLG\
 PRE=$PWD\ #程序运行的根目录,所有的其他目录全在该目录下
 REFERENCE_NAME=.genome \ #参考基因组目录名称,位于PRE目录下,若有参考基因组,可放于此目录下。
 DATA_SUBDIR=data\ #DATA子目录,位于REFERENCE_NAME目录下,程序从该目录下读取数据。
 RUN=run\  #位于DATA_SUBDIR目录下,将生成的中间文件和结果文件存储与该目录中。
 SUBDIR=test\
 TARGETS=standard\
 OVERWRITE=True\
 | tee -a /02allpaths/assemble.out

专注:assemble.sh文件中多少个目录的路子的安装。

接着正是长久的结果等待啦~~~

是因为组装须求的内部存款和储蓄器不小,必定要保管内部存款和储蓄器,不然会运作到五成会被去除。

本着这种场地,赵方庆公司开拓了依靠间接连接消息的基因组组装算法inGAP-sf。该格局根据德布鲁因图的特征,基于contig的重叠部分创设了直接连接新闻图,在匹配成对三番五次音信的督察下拓扑路线,并对这个渠道举行整合,同不经常间引进了贝叶斯模型用于去除错误路径,进而赢得高水平的拼凑结果。通过在七个模拟数据和真正测序数据上的测量检验,inGAP-sf的结果与其余方法得到的拼接种类相比较,三翻五次性、准确性、完整性都有水落石出的提升。该钻探采用的拼接计策比非常大程度地健全了已有种类组装算法的供应不能满足需要,为体系拼接提供了新的笔触。inGAP-sf已宣布在

基因组拼接和转录组拼接

Problem Structure Coverage
Heterozygous genome Combines two dissimilar genomic graphs Equal coverage of the two
Metagenome Combines hundreds of similar or dissiminar genomic graphs Widely varying coverage
Transcriptome Combines thousands of graphs from genes Widely varying coverage

不等的拼接内容需求分裂的拼凑战术,其缘由如上航海用教室所示,即不一样的数目爆发的DBG结构和覆盖度分化。

对此转录组拼接来讲,借使假设叁个转录组独有多个基因而且那四个基因未有重新区域,那只必要营造四个从未关系的DBG就足以了。

图片 6

对于实际多少来说,一个转录组包罗了好些个个基因。且超过五成基因没有overlap,大家营造的DBG实际上是广大不相干grphs的集结,每一个图都代表三个基因可能三个基因家族。下边包车型大巴暗指图展现营造了七个基因的图并且也显示了其覆盖度的歧异,当中基因2和3只怕是八个可变剪切或许三个家族特别周围的多个基因。

图片 7

通过上海教室也能够开采,转录组拼接最大的标题在于kmer数目标轻重非常大程度上取决于有个别基因的表明量高低。倘诺把kmer
cutoff 设置的高级中学一年级些,那么低表明的基因就可能拼不起来。

在基因组拼接进度中,kmer coverage
平日是单峰也许是双峰,不过转录组拼接差别。转录组拼接中,每二个基因的kmer遍布大概是一个单峰,peak的地方取决于基因表明量的有个别。而完全的布满则是具有这么些单基因分布的总的数量。

转录组拼接时应有专注那样量个难题。首先,转录组拼接已经不满足DBG算法中覆盖度均一的比如,表明量非常高的基因或者调节拼接的结果,由此必要能调动这种覆盖度的差异。别的,转录组拼接不用太操心低复杂度区域,不会有多数种复区域出现。

转录组拼接常用软件:trinitySOAPdenovo-trans(华大);Trans-ABySSbridger

4.2 将法斯特q调换为ALLPATH-LG支持的输入格式
#!/bin/sh
#这个为prepare.sh文件
# ALLPATHS-LG needs 100 MB of stack space.  In 'csh' run 'limit stacksize 100000'.
ulimit -s 100000 #程序中需要较大的堆栈空间,使用ulimit将计算资源放宽松些。

mkdir -p /02allpaths/data #用于将转换后的数据文件放入到此目录下。

# NOTE: The option GENOME_SIZE is OPTIONAL. 
#       It is useful when combined with FRAG_COVERAGE and JUMP_COVERAGE 
#       to downsample data sets.
#       By itself it enables the computation of coverage in the data sets 
#       reported in the last table at the end of the preparation step. 

# NOTE: If your data is in BAM format you must specify the path to your 
#       picard tools bin directory with the option: 
#
#       PICARD_TOOLS_DIR=/your/picard/tools/bin

PrepareAllPathsInputs.pl\

 DATA_DIR=$PWD/genome/data \
 PLOIDY=2\ #生成ploidy文件,1表示基因组为单倍体型;2为双倍体型。
 IN_GROUPS_CSV=in_groups.csv\
 IN_LIBS_CSV=in_libs.csv\
 OVERWRITE=True\
 | tee prepare.out 

运转以上命令,将fastq文件转成运转ALLPATH-LG所急需的公文,并贮存到/02allpaths/data文件夹下。

该职业由赵方庆课题组的史文聿和冀培丰共同完结,并收获国家自然科学基金委员会和科学和技术部首要研究开发计划的经费援助。

假kmer

在一回测序获得的数码中,kmer matches
的数额和测序深度以及read长度相关。倘使在完全未有测序错误的数码中,read长度是100,测序深度是50X,采用kmer值为21,那么一个只万分基因组一回的kmer
出现的次数应当是$(100-21+1)*50/100=40$(基因组的每一个地点被测了50遍,100bp的read有77个21bpkmer),如若协作基因组一次的kmer应该出现七十九遍。因而,峰值应该在40,80的任务有三个小峰。

可是,当存在测序错误的时候,会在十三分1次的任务出现大量的kmer,正是由于测序的测量误差导致的。为何就是测序错误呢,因为在50x的测序中只出现了一回,假若叁个read中有二个碱基错了,那么这一个read就能够生出十多个错误的21kmer。更加大的难题是,随着测序深度的扩充,那样错的kmer数量也会追加,

2. nxtrim文库分选

nxtrim分开PE和MP文库。
该软件会用于去除Nextera Mate Pair
文库中级知识分子道何况根据知情地方的来头分类reads。
内部的每种read都会招来接头消息(CTGTCTCTTATACACATCT)和她的反向体系(AGATGTGTATAAGAGACAG),因而这几个欧洲经济共同体的接连接头是CTGTCTCTTATACACATCT+AGATGTGTATAAGAGACAG

nxtrim -1 reads1 -2 read2 -O folderfile --joinreads --preserve-mp --separate 1 > read_nxtrim.log 2 >&1

注:该软件的暗许参数–rf 会将MP文库的reads方向转换回去。

图片 8

nxtrim.png

个中的MP和PE 的文书即为所得。

舆论链接

东拼西凑的搅拌因素

在实际上情况中,拼接往往是在覆盖度不均匀且含噪声的数目中开始展览,那为拼接带来了多个地点的劳苦:

  1. 追加了汪洋假kmer进而提升了对缓存的渴求
  2. 漏洞相当多的reads通过扩张tips,bubbles和corss-links等转移了DBG的组织
  3. 不联合的read覆盖度使得拼接参数对拼接结果有那些大的熏陶

答辩部分

该片段参照他事他说加以考察及引用陈连福的生信讲义,zhaofei的https://vip.biotrainee.com/d/103–。

出于仪器测序读长的界定等,在建库时会将DNA随机打断为小一些的连串,由此,基因组组装就是将小部分的行列连接起来,可是系列之间的维系十一分复杂,常用塑造Graph来张开表示,然后在对Graph进行简化、拼接,即reads→contigs→scaffolds。

下图即为轻便的暗意图,个中顶点A,B,C,D,E,F称为nodes,是6条小片段种类;连接2个nodes的有来头的箭头称为edges,那个边表示reads间的overlap;而数字代表着权重。通过对Graph进行深入分析,采纳权根本的来简化Graph,获得ABCDEF这一个行列,就那样类推,将基因组发生ABCDEFGH…等若干的reads,再根据各reads间的重复区域,选出最优路线,变成contigs,再组成scaffolds,最后获得基因组连串。

图片 9

创立暗中表示图.png

查究最优路线的常用算法:

最初选取的是贪婪法
:先选定初始read,找到和其重叠区域最高的read进行延伸,直至拼接后的read两端不能再开展缓延长伸停止。每一回延伸都以从最优相配起来的,贪婪法获得的是一对最优解,并不是大局最优解,由此,在遇见重复连串时会出现非常大的主题材料。

Overlap-Layout-Consensus(OCL)
常用语处理reads读长极大的测序数据,比如PacBio数据的建构。OLC算法分为三步:1)对全部的reads进行两两比对,得到overlap。2)依据overlap简化graph,建构overlap图,将reads组合成contig。3)得到consensus:将富有read序列排列起来,找到一条从先导节点到终止节点的特等近似路线使得最终路线将会遍历一次重合区域的各样节点,进而得到目的基因系列。

de Bruijin
Graph(DBG)
是时下常用的二代测序拼接算法。相关软件:ALLPATHS-LG、SOAPdenovo等。该算法和OLC类似,不一致之处在于:该算法中的nodes是kmer连串,kmer和kmer必须独有三个碱基差距本领不断,即相邻的kmer连串是经过k-1个碱基连接到一齐的(每一趟只移动多少个岗位)。这种算法裁减了重复区域的复杂度,减弱了内部存款和储蓄器消耗。其步骤:1)创设DBG图,将reads分割为一密密麻麻一连的kmer;2)合併DBG图;3)创设contig:寻觅最优路线(经过每二个节点且仅经过贰次),最优路线对应的碱基类别构成一个contig;4)营造scaffold:通过PE
reads地点显明contig之间的对峙地方和趋势,组装contig,填充contig之间的gap,获得scaffold连串。

鉴于DBG营造没有供给reads具备endanger的长度,由此只适用于reads长度相当的短的Illumina测序数据。也就此DBG对于再度区域相比较狠深入分析,实行de
novo组装时须求营造大片段文库,测MP数据,只要MP文库长度超越重复种类长度,则有利重复类别的建构。

kmer和内存

k值越大可甄别越多的小重复种类,越轻便把DBG转变为唯一的体系,但获得的拼凑进程含有更加多的gaps;小的k值对应的DBG可以获取较好的连通性,可是算法的复杂度会进步,repeats系列管理会更头晕目眩,扩张了错拼的或然。

kmer越大要求的内部存款和储蓄器就越多,所以计算机的内部存款和储蓄器大小也会限制kmer的取值。这里要求表明的是,输入数据的有一点点不会潜移暗化memory用量,不过输入数据的荒谬越少,占用的内部存款和储蓄器也就越少,假诺全体测序数据都尚未别的不当,那么DBG的高低并不会因为测序深度的扩大,因为无需将因为多少个碱基不平等的kmer存入到DBG中(下局地会实际涉及)。至于须要多大的RAM则在于DBG的分寸和建构基因组的分寸。

除此以外,在拼接的进程中尽量制止使用偶数kmer,不然轻易是kmer发生回文系列,非常是在链特意性的数据中。

在通常分析中,一般会设置一个kmer的梯度(21,23,25,27,2931),来减轻DBG算法loss
of read
coherence的难点。然后从中采纳最棒的结果。别的,还恐怕有一种说法是在进展拼接进度时,kmer应该采用read长度的59%到2/3高低,不然或然拼接出过多的Contig。

String Graph能较好的建构散在再次体系。

时下创设Graph的点子主要有3种:Overlap-Layout-Consensus(OCL),de Bruijin
Graph(DBG)和String Graph。

图片 10

Greedy extension

贪如虎狼算法(贪心图)是中期提议的拼凑算法。首先选定初步read,
然后找和其重叠区域最高的read实行延伸,直到拼接后的read两端都不可能再举办增添截至。

每一趟都以从最优相配起来,然后次优相称,到不能够相配时停止。那样一来,贪婪算法经常会获取一些最优解,并非大局最优解。由此,这种算法在遇见重复系列时会出现相当的大的主题素材。

A greedy assembler compares all pairs of read fragments continually
and replaces any pair with sufficient overlap between the edges with a
combined sequence. The assembly completes, when the edges of the
remaining sequences do not have any significant overlap.

1. fastqc软件利用查看数据原始品质

find ./ -name "*.gz" |xargs fastqc -t 3 -o ./result 

xargs命令的用法:

里头管道和xargs的界别:管道是促成“将前方的行业内部输出作为前边的正规输入”,xargs是达成“将规范输入作为命令的参数”。能够试试上边两代码的结果

echo "--help"|cat #此处结果是显示 “--help”
echo "--help"|xargs cat #此处结果是显示cat的帮助说明文档 相当于 cat --help,即xargs是将内容作为普通的参数传递给程序
cat gzip.sh|xargs -i echo "quick_qsub {}"

获得的结果是回顾:

图片 11

image

貌似是翻开网页版结果,结果表达表达fastqc粤语结果注解。

fastqc
软件首假诺针对全基因组测序的,何况各建库方法不一致,其剖断标准也会全体区别;不能够只是一向的寻求全体结果通过。

ls *zip|while read id;do unzip $id;done #批量解压压缩结果

从文件夹中批量抓取里面包车型地铁%GC,Total sequences等音讯

Q20:品质值凌驾20的碱基数目占总共碱基数指标百分比。

multiqc *fastqc.zip --pdf #

图片 12

image

长久以来,重复连串都以基因组拼接的主要性限制因素,而带有短片段重复种类区域的组装更是难以赶过的障碍。那有的系列的缺点和失误会导致基因断裂,使少数注重遗传新闻在一而再的钻研分析中被遗漏。从前的种类组装算法仅仅使用配成对连日新闻,忽视了contig自己的连日关系,不止使算法难度增添,並且拼接结果也存在间隙连串多、错误总是多等难点。非常是对此短片段重复连串,历来的创立算法都接纳直接遗弃,使得短片段重复连串富集区域不能够有效拼接。

kmer和内存

在拼接相关的篇章中,kmer是出新频率十三分高的二个词。而kmer在漫天生物消息深入分析进程中的用处也是十分之多。这里有一份资料举办了相比详细的牵线

k值越大可甄别更加多的小重复体系,越轻便把DBG转换为独一的系列,但获得的拼凑进程含有越多的gaps;小的k值对应的DBG能够获得较好的连通性,可是算法的复杂度会提升,repeats类别管理会更目不暇接,扩充了错拼的大概。

在拼接数据预处理软件khmer的文献中有与此相类似一段关于kmer和内部存款和储蓄器大小与管理结果关系的描述:

The interaction between these three parameters and the filtering
process is complex and depends on the data set being processed, but
higher coverage levels and longer k-mer sizes result in less data
being removed
. Lower memory allocation increases the rate at which
reads are removed due to erroneous estimates of their abundance
, but
this process is very robust in practice

kmer越大须求的内部存款和储蓄器就越来越多,所以计算机的内部存储器大小也会限制kmer的取值。这里要求表达的是,输入数据的略微不会影响memory用量,然而输入数据的荒谬越少,占用的内部存款和储蓄器也就越少,假若全数测序数据都未有其余不当,那么DBG的大大小小并不会因为测序深度的增添,因为不须求将因为多少个碱基不雷同的kmer存入到DBG中(下局地会实际涉及)。至于须求多大的RAM则取决于DBG的轻重和建设构造基因组的高低。

别的,在拼接的进程中尽量幸免使用偶数kmer,不然轻便是kmer发生回文种类,非常是在链特意性的多寡中。

在平常解析中,一般会设置叁个kmer的梯度(21,23,25,27,2931),来消除DBG算法loss
of read
coherence的主题材料。然后从中选用最棒的结果。其余,还应该有一种说法是在拓展拼接进度时,kmer应该选择read长度的49%到2/3大小,不然大概拼接出过多的Contig。那或多或少,也说不定是我们日常使用trinity拼接时拼出Contig
过多的源委,trinity的默许拼接大小是25。上限是32?(有待显明)。假如kmer有上线,是不是也能够思量在预管理的时候,管理的力度大学一年级点,把连串截短一些?

4. ALLPaths-LG组装(仿照效法陈连福生信讲义)

动用ALLPATHS-LG的规格比较严刻,有以下的注意事项:

1.无法只使用贰个library数据进行组装;

2.务必有二个“overlapping”的一部分文库的PE数据;

3.必须有jumping library 数据(也便是Illumina Mate-pair测序数据)

4.基因组组装供给有100X要么以上基因组覆盖度的碱基,这里的覆盖度是指raw
reads数据的覆盖度;

5.方可选拔PacBio数据;

6.不能够利用454数码和托雷nt数据;

7.输入10G的碱基数据量,大概供给17G内部存款和储蓄器;

8.对此试探性的参数,比如K,原则上得以调动;不过一般不自行调度,也不引入。本软件中Kmer大小的参数K和read之间从未一直的维系,其会在运营进程中选用一层层的K值。

inGAP-sf算法流程

东拼西凑基本原理

东拼西凑能够分为基因组和转录组拼接,基因组拼接对数据量和测序深度需求更好,而转录组用平常的SportageNA-seq数据就足以。前段时间手里越来越多的是冠道NA-seq数据,所以做的也是和转录组拼接相关的源委。

不论拼基因组依然转录组,百川归海都是拼DNA连串。拼接最轻便易行的逻辑正是三个由让由长变短再由短到长的进度,基因打断成三个个有的实行测序,生成测序数据,然后再用reads拼成contigs再拼成scaffolds。

从reads到contigs的长河中,供给展开多类别比对并将同一的 reads(consensus
sequence)拼接起来来生成contigs,当中最大的标题是基因组上设有大气重新区域,会对拼接带来麻烦。Scaffolds数据则是通过pair
end reads 新闻来剖断contigs 的一一、方向和隔壁 contigs
之间的豁口(gap)大小来变化的。从contigs到scaffolds是贰个排序和定向的进度。

有关拼接,Biostar大牌Istvan 艾Bert在二个答复下边争论道:Assembly is
somewhat of a “dark art”

实际操作部分

应用ALLPaths-LG组装举行基因组组装,适合于短reads数据,也是后天公众认同的开始展览基因组De
novo 组装效果最佳的软件。不过该软件十三分消耗内部存款和储蓄器和计量。

Overlap Layout Consensus

OLC图算法首即使用来针对长reads种类拼接,如一代测序数据(三代测序数据),轻松了然正是把测序产生的长种类用相互之间的overlap区域连接起来。对于数据量非常大的数额或许全基因组数据的话,形成的olc图特别复杂,会成本一大波内部存款和储蓄器。

OLC算法共有三步:

4.1 准备in_groups.csv和in_libs.csv文件

in_groups.csv用于建议测序数据的寄存路线,

其中file_name:数据文件所寄存地点,文件名能够分包‘*‘和’?’,进而代表paired数据。协理的文件类型有“.bam,.fasta,.fa,.fastq,.fq.,fastq.gz,.fq.gz”。

file_name, library_name, group_name
HoS150_peQ20-1_R?.cut.fq.trimmed.paired.fastq,     PE1,       PE01
HoS_mp1_R?.fastq, MP6-1,      HoS250_6-1
HoS_mp2_R?.fastq, MP6-2,      HoS250_6-2
HoS_mp3_R?.fastq, MP6-3,      HoS250_6-3

in_libs.csv用于给出文库的表征。

其中:library_name指文库的名字,和In_groups.csv相匹配。type文库类型:fragment→PE测序;jumping→MP测序;long→Pacbio测序。read_orientation
reads的取向,小片段文库为inward,大一些文库为outward。可是供给专注的是nxtrim软件中私下认可是将大片段文库的趋向改动为inward。

library_name, project_name,     organism_name,        type,     paired,   frag_size, frag_stddev, insert_size, insert_stddev,    read_orientation, genomic_start, genomic_end
PE1, HoS, RFgenome, fragment, 1, 287, 50,, , inward,   0, 0
MP6-1,  HoS, RFgenome,  jumping, 1,  , ,  2290,220,inward,  0, 0
MP6-2,  HoS, RFgenome,  jumping, 1,  , ,  2808,  318,  inward,  0, 0
MP6-3,  HoS, RFgenome,  jumping, 1, , , 3954, 750,  inward,  0, 0

东拼西凑常用算法

当前常用的拼接算法都以基于数学中的图论观念(Graph
theory)产生,个中图论中的多个点表示八个read,而两点之间的连线表示两条read的交汇区域。拼接要做的事体就是在有着的终南捷径中找最优解,类似于时辰候玩过的单笔画难点。

图片 13

图片 14

图片 15

如上海教室左所示,一个粗略的基因组产生了ABCD……若干read,在地道的情景下大家能够依据全部reads相互的重合区域重构出圆圈所代表的基因组。就算简化成图来表示则应当是上海教室右的所示,全体黑连接的是不错的基因组,但实际上情状是基因组有不胜枚举区域相比一般,以致于类别间会发出本未有的联系(如红线所示)。

在张开上述深入分析进程时,供给把具备的reads都开展比对,以便找到重叠区域,这几个手续极度成本总计能源。Graph画出来以后的标题就是何许从中获得最优路线,即从有各类reads组合措施中找到从合适的二个变异contig。

上面是寻找最优路线的常用算法。

3. bwa比对获得插入片段文库

bwa mem -M ref.fa reads1.pe.fq.gz reads2.pe.fq.gz > read.pe.sam
bwa mem -M ref.fa reads1.mp.fq.gz reads2.mp.fq.gz > read.mp.sam
perl count_num_sam.pl read.pe.sam
perl count_num_sam.pl read.mp.sam 

SAM文件中第9列是建库时候的堵塞的一对长度,如若选拔的是PE150的多少,那么打断成350bp,则这里的多寡应该是349个字符左右。

#!/usr/bin/perl   #count_num_sam.pl;提取sam文件中第九列,统计每个插入片段长度的个数
open FH,'>',"$ARGV[0].count.out" or die;
my @num;
my $i = 0;
while(<>){
        next if /^\@/;
        if(/(?:.*?\s){8}(-?\d+)\s.*/){
                $num[$1]++ if($1>=0);
        }
}
$num[0] = $num[0]/2;
for($i=0; $i<20001; $i++){
        if($num[$i] == 0){
                print FH "$i\t0\n";
        }else{
                print FH "$i\t$num[$i]\n";      
        }        
}

用excel获得插入片段的图,平均值总括方法是:(A+B)/2;偏差值=平均值-A。

图片 16

插入片段长度图.png

据悉实验中挑选文库的原理(如下图),对于同一个Well的多少,其index同样,则其MP文库插入片段遍布一致,此类数据只需深入分析一个安顿片段的图就能够。对于同三个Fragment,其PE文库插入片段布满一致,同理此类数据只需剖析二个布署片段的图就能够。

图片 17

文库创设.jpg

改造结构

荒唐的reads 会为DBG引进三种档案的次序的不当

tips

所谓tips指五个小分支,下图所示,我们有5条10bp的reads,当中第5条有二个碱基测序错误。使用7kmer会产生12个节点。假若用前4个read来拼是常常的,一旦引进第五条就可以因为二个错误的碱基出现一条错误的有多个节点的分段。

图片 18

图片 19

在大气凑合的历程中,多量的read会相配到科学的地点,一小部分会比配到不当的岗位,由此可以对错误的tip举行破除。

图片 20

bubbles

当read和kmer比较丰裕长时,错误或然出现read中间。此时会并发bubble的事态

图片 21

内需专注的是,除了测序错误以外,可变剪切和snp以及插入缺点和失误等也会招致tips的产出,由此扩大了拼接的难度。因而,在张开拼接之间有不可缺少对原有数据举办预管理。

覆盖度不平衡

在事实上拼接进程中,会去除一些低频率的kmer,这一操作在剔除了大气不当kmer的还要,大家也不可制止的删减了比相当多是因为覆盖度低所以出现次数低的kmer。

综上,假如调低cutoff,高覆盖区域出错的只怕就高,可是低覆盖区域的质量晋级。kmer长度增添会使低覆盖区域尤其分散,因为kmer的覆盖度会因为小于设置的cutoff被删除。

图片 22

趁着kmer的充实,分支会日益压缩,DBG会越发趋向于线性。对于二个极大的kmer,恐怕就完全线性,同期遵照染色体分开。拼接品质一般会随着k值的充实先变好然后再变坏,因为这些进度中留存两种竞争性的过程。一方面,kmer的扩张能够更加好的拍卖重复区域,不过另一方面,由于覆盖度的来头,kmer的充实在有些区域使得他们出现的次数越来越低直到低于筛选的阈值。所以,kmer
的挑选非常主要。

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东拼西凑质量的评估

基因组层面包车型大巴拼接品质,一般会相比青睐长度相关的目的。举个例子最大尺寸、平均长度、拼接后的总参谋长度和
contig N50长短。

Contig N50 指 reads 拼接后拿走部分不等长度的 contigs,将兼具的
contigs 长度相加获得总院长度。然后将具备的 contigs
遵照长度从长到短进行排序,再将 contigs 遵照那几个顺序相加,当长度等于
contigs 总委员长度的百分之五十时,最后八个增进的 contig 的长短称为 contig
N50。对于总省长度分化的多个拼接数据,直接比较N50 的数值没有啥意思。

对于转录组拼接来讲,并非越长越好,大家更在意的是东拼西凑的材料,方向和回帖率等等音信。假如大家在转录组拼接进度中选拔了kmer=25这些参数,在拼接好后应该用拼接的fastq文件mapping回拼接好的转录组,测验mapping作用,这里推荐使用salmon软件,供给小心salmon中的kmer应该和拼接时接纳的kmer保持一致。

除此以外,transrate是四个特地用来评价拼接品质的软件。在下文的骨子里运用有的会有介绍。


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踏入可相信熊集散地,和豪门一块儿调换

前前后后做了有些转录组拼接的工作,何况这段时间还在不停开始展览中。时期境遇了美妙绝伦莫明其妙的坑,也尝试了一些分化的诀窍和软件。做七个阶段性记录和小结。本篇是原理部分。

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