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物工学家使用新示踪本事揭破非肌肉细胞命局,物文学家创造更为精准的谱系示踪技能

2019年6月23日 - 美高梅mgm02233.com
物工学家使用新示踪本事揭破非肌肉细胞命局,物文学家创造更为精准的谱系示踪技能

4月26日,国际学术期刊Circulation在线发表了中国科学院生物化学与细胞生物学研究所周斌研究组的研究成果:Genetic
Lineage Tracing of Non-myocyte Population by Dual
Recombinases
。该研究工作利用新建立的双同源重组技术系统揭示了在胚胎心脏发育、成体心脏稳态维持及损伤修复、成体骨骼肌稳态维持和损伤修复过程中,非肌肉细胞分化形成肌肉细胞的潜能。该研究成果有助于深入了解不同器官,或同一器官的不同发育阶段,非肌肉细胞的转分化作用,为肌肉的再生医学研究提供新的思路。此外该技术并没有依赖特定的干细胞分子标记去研究组织中是否存在干细胞向功能细胞分化过程。

生化细胞所 科学家创建更为精准的谱系示踪技术

近日,中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所周斌研究组的科研成果,以Enhancing
the precision of genetic lineage tracing using dual
recombinases
为题,在线发表在Nature
Medicine
上。该研究将Dre-rox同源重组系统引入到传统的基于Cre-loxP同源重组系统的遗传谱系示踪技术中,有效地规避了由于Cre表达的不特异性而导致的非特异性同源重组,实现了更为精准的遗传谱系示踪,为发育、干细胞及再生等领域的深入研究奠定了可靠的技术基础。

心脏作为脊椎动物最重要的器官之一,主要功能是为血液流动提供动力。心脏发生心肌梗塞后造成心肌细胞大量死亡,心脏功能受到影响。成体心脏是否存在心肌干细胞一直存在争论,之前的研究利用传统的遗传谱系示踪技术认为在成体心脏中存在心肌干细胞,例如Kit+心肌干细胞,Bmi1+心肌干细胞,Scal1+心肌干细胞,Islet+心肌干细胞等,但由于这些心肌干细胞的分子标记本身就表达于部分心肌细胞中,因此这些假设的心肌干细胞向心肌细胞的分化潜能受到质疑。

本报讯
中科院生物化学与细胞生物学研究所研究员周斌研究组在一项最新的研究中将Dre-rox同源重组系统引入到传统的基于Cre-loxP同源重组系统的遗传谱系示踪技术中,有效地规避了由于Cre表达的不特异性而导致的非特异性同源重组。相关研究成果日前在线发表于《自然—医学》。

遗传谱系示踪技术是揭示特定类型细胞在发育、疾病和再生中转分化现象的有效研究方法,目前,体内的细胞追踪技术主要基于Cre-loxP同源重组系统。在含有Cre的转基因小鼠中,Cre由于在特性基因的启动子驱动下,表达在特定的细胞类群中,当Cre小鼠与含有loxP位点的报告基因小鼠交配时,Cre通过识别loxP位点,将两个loxP位点之间的终止序列切除,从而使含有Cre的细胞类群表达出报告基因,由于这种切除是位于基因上的,从而是永久性的和不可逆的,因此,所有表达Cre的细胞类群及其后代(无论是否表达
Cre)都将永久的被报告基因蛋白标记上,因此,利用该细胞追踪技术可以解析特定细胞的起源和命运。

在该项研究中,研究人员利用双同源重组技术同时对肌肉细胞和非肌肉细胞进行谱系示踪,系统揭示非肌肉细胞向肌肉细胞分化的潜能。在胚胎心脏发育早期,Isl1+的心肌干细胞可以贡献第二心区的心肌细胞,例如,心脏的流出道,右心室部分的心肌细胞,以及左心室和心房非常少量的心肌细胞均来自于Isl1+的心肌干细胞。研究人员利用双同源重组技术特异性地对胚胎早期的非心肌细胞进行遗传谱系示踪发现,在胚胎心脏发育早期,非心肌细胞具有分化形成心肌细胞的能力,这些非心肌细胞可以贡献形成第二心区的心肌细胞。在成体心脏的稳态维持过程中,研究人员利用双同源重组技术对非肌肉细胞和肌肉细胞同时谱系示踪发现,非肌肉细胞和肌肉细胞维持各自的细胞命运,非肌肉细胞不会转分化形成肌肉细胞,而在成体心脏发生心肌梗塞后,造成心肌细胞大量死亡,心脏功能受损,但心脏中肌肉细胞和非肌肉细胞依然维持各自的细胞命运,非肌肉细胞不会转分化形成肌肉细胞来弥补死亡的肌肉细胞,即成体心脏在稳态维持和损伤修复过程中都不会发生非肌肉细胞向肌肉细胞的转分化。骨骼肌在稳态维持过程中,肌纤维细胞与非肌肉细胞发生融合,肌纤维细胞处于多核状态,而当对骨骼肌实施BaCl2损伤后,骨骼肌中肌纤维细胞大量死亡,但在骨骼肌的损伤修复过程中,研究人员发现骨骼肌中的非肌肉细胞可以转分化形成肌纤维细胞,促进骨骼肌的损伤修复。以上研究成果将为肌肉的再生医学提供理论基础。

据介绍,目前,体内的细胞谱系示踪技术主要基于Cre-loxP
同源重组系统。Cre在特性基因的启动子驱动下,表达在特定的细胞类群中,当Cre小鼠与含有loxP位点的报告基因小鼠交配时,Cre
通过识别loxP位点,将两个loxP位点之间的终止序列切除,从而使含有Cre
的细胞类群表达出报告基因。由于这种切除是位于基因上的,从而是永久性的和不可逆的,因此,所有表达Cre的细胞类群及其后代(无论是否表达Cre)都将永久地被报告基因蛋白标记上,因此,利用该细胞追踪技术可以解析特定细胞的起源和命运。

尽管基于Cre-loxP系统的遗传谱系示踪技术是研究发育、疾病、再生等过程细胞命运可塑性的强大利器,但它本身也存在技术瓶颈。该技术的准确性主要依赖于Cre表达的特异性,如果有微量的Cre表达在了非靶向细胞中即为所谓的异位表达,那么谱系示踪结果的可靠性将降低,而这也成为近年来很多科学问题出现争议的主要原因之一。

该研究工作是由博士生李燕、副研究员何灵娟等在研究员周斌的指导下完成的。该研究工作得到香港中文大学教授吕爱兰等的大力支持,同时得到中科院、国家基金委、科技部、上海市科委等资助。

“尽管基于Cre-loxP系统的遗传谱系示踪技术是研究细胞命运可塑性的强大利器,但是它本身也存在着技术瓶颈。”周斌表示,该技术的准确性主要依赖于Cre表达的特异性,如果有微量的Cre表达在了非靶向细胞中即为所谓的异位表达,那么谱系示踪结果的可靠性将大大降低,而这也成为了近年来很多科学问题出现争议的主要原因之一。

为了解决这一技术瓶颈,周斌研究组开发了一种新的谱系示踪技术,称为DeaLT(Dual-recombinase-activated
lineage
tracing),该技术将Dre-rox同源重组系统与传统的Cre-loxP同源重组系统结合,Dre-rox介导的同源重组反应在可能引起Cre异位表达的细胞中将Cre重组酶的识别位点loxP切除掉,有效地阻止Cre-loxP的异位同源重组,增加Cre-loxP介导的谱系示踪结果的准确性。该系统包含两种策略,分别是DeaLT-IR和DeaLT-NR。DeaLT-IR策略的报告基因小鼠上包含的两个loxP位点和两个rox位点以交错形式存在(loxP-rox-loxP-rox),该策略适合组成性Dre与诱导性Cre相结合;而DeaLT-NR策略报告基因小鼠上的loxP位点和rox位点以嵌合的形式存在(rox-loxP-loxP-rox),该策略适合诱导性Dre和诱导性Cre相结合。

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为了解决这一技术瓶颈,何灵娟博士等在周斌指导下开发了一种新的谱系示踪技术称之为DeaLT。该技术将Dre-rox同源重组系统与传统的Cre-loxP同源重组系统结合起来,Dre-rox
在可能引起Cre异位表达的细胞中将loxP位点切除掉,从而有效地阻止了Cre-loxP的异位同源重组,增加了Cre-loxP介导的谱系示踪结果的准确性。该系统包含两种策略,分别是DeaLT-IR
和DeaLT-NR。DeaLT-IR策略适合组成性Dre与诱导性Cre相结合,而DeaLT-NR策略适合诱导性Dre和诱导性Cre相结合。

系统创建后,周斌研究组首先利用DeaLT-IR策略解决成体心脏c-Kit+心脏干细胞的问题。成体c-Kit+干细胞是否能够分化形成心肌细胞之所以存在争议,主要由于c-Kit除了表达在非心肌细胞中以外,本身还微量地表达在心肌细胞中,传统的示踪技术利用Kit-CreER无法做到单纯示踪c-Kit+干细胞,而利用新开发的DeaLT系统阻断了心肌细胞中Kit-CreER的同源重组反应,实现非心肌细胞中c-Kit+干细胞特异性的遗传谱系示踪。结果发现,c-Kit+干细胞在成体心脏生理稳态和损伤修复过程中均不会分化形成心肌细胞,主要是通过血管新生参与心脏修复。此外,利用DeaLT-NR系统解决了肝脏领域有关Sox9+肝组细胞能否转分化形成肝细胞的争议问题,造成该争议的原因是Sox9除了表达在胆管上皮细胞中还少量的表达在胆管周围的肝细胞里面,传统的谱系示踪技术利用Sox9-CreER标记了胆管上皮细胞和胆管周围的一部分肝细胞,因此很难判断损伤后Sox9-CreER标记的新生成的肝细胞到底来自哪一部分。DeaLT技术阻断Sox9-CreER在肝细胞中的同源重组反应,实现Sox9+胆管上皮细胞中特异性的遗传谱系示踪,结果发现在肝脏生理稳态和损伤修复过程中Sox9+胆管上皮细胞并不会转分化形成肝细胞。DeaLT策略不仅提供更精确的Cre重组酶的控制,并为Cre表达细胞的谱系追踪设定更高的技术标准,但它也足够灵敏以检测体内谱系转换事件。以肝损伤后肝细胞转分化形成胆管上皮细胞为例,DeaLT策略能清楚地展现肝损伤后肝细胞能够转分化形成胆管上皮细胞的过程。因此,这种新策略可用于揭示细胞命运转变,也严格控制潜在的非靶向细胞表达Cre介导的异位谱系追踪,为多个研究领域更准确地解析细胞起源和命运提供了有效手段。

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据悉,该系统创建成功后,研究人员首先利用DeaLT-IR策略解决了成体心脏c-Kit+心脏干细胞的问题。该科学问题存在争议的主要原因是c-Kit
异位表达在心肌细胞中,传统的示踪技术利用Kit-CreER无法做到单纯示踪非心肌中的c-Kit+干细胞,而利用DeaLT系统阻断了心肌细胞中Kit-CreER的同源重组反应,成功地实现了非心肌细胞中c-Kit+干细胞特异性的遗传谱系示踪。研究结果发现,c-Kit+干细胞在成体心脏生理稳态和损伤修复过程中均不会分化形成心肌细胞,主要通过血管新生参与心脏修复。

研究工作得到了中科院、基金委、科技部以及上海科委等的支持。

非肌肉细胞向肌肉细胞转分化的潜能

同时,利用DeaLT-NR系统解决了肝脏领域有关Sox9+肝组细胞能否转分化形成肝细胞的争议问题。Sox9除了表达在胆管上皮细胞中还少量地表达在了肝细胞里面,传统的谱系示踪技术利用Sox9-CreER标记了胆管上皮细胞和一部分肝细胞,因此很难判断损伤后Sox9-CreER标记的新生成的肝细胞到底来自哪一部分。DeaLT技术实现了Sox9+胆管上皮细胞中特异性的遗传谱系示踪,结果发现在肝脏生理稳态和损伤修复过程中Sox9+胆管上皮细胞并不会转分化形成肝细胞。

论文链接

《中国科学报》 (2017-11-27 第5版 创新周刊)

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DeaLT策略可以阻断CreER在B细胞中的非特异性的同源重组反应,实现A细胞特异性的谱系示踪。

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